Оценка на генотоксичния потенциал на комбинираното въздействие на УВ облъчване и други фактори от околната среда при групи висши растения от някои местообитания в Рила планина
Участници в изпълнението на дейностите по работния пакет:
доц. д-р Габриеле Йовчев, ИБЕИ-БАН,
гл. ас. д-р Светла Гатева, ИБЕИ-БАН,
биол. Александър Станков, ИБЕИ-БАН
Осъществени бяха командировки в местностите: „Скакавците“ над с. Бели Искър-1500 м. н.в., „Трети прозорец“ - 1782 м. н.в. и връх Мусала-2925 м. н.в.. Проучен беше видовият растителен състав и бяха избрани експерименталните площадки.
1. Растителността на експерименталните площадки до сградата на „Скакавците“ над с. Бели Искър е от планинско- ливаден тип, като установените растителни видове бяха: 6 вида от сем. Poaceae (житни), 5 вида от сем. Fabaceae (бобови), 2 вида от сем. Juncaceae (дзукови), разнотревие - 45 вида, храстова растителност-1 вид и дървесни видове – 4 вида.
2. В местност „Трети прозорец“ растителността беше представена от дървесни видове - 7 вида, храсти – 3 вида. На откритите места от планинско- ливаден тип бяха установени растения от сем. Poaceae (житни) - 6 вида, сем. Fabaceae (бобови) - 4 вида, сем. Juncaceae (дзукови) – 2 вида и разнотревие – 39 вида.
3. На връх Мусала растителността беше представена от малко на брой видове - сем. Poaceae (житни), сем. Saxifragaceae (каменоломкови), сем. Asteraceae (сложноцветни), сем. Scrophulariaceae (живеничеви), сем. Boraginaceae (грапаволистни).
През месец юни, юли и септември от избраните експериментални площадки бяха взети растителни проби от видове, подходящи за анализ на генотоксичният потенциал на UV радиация, обща β- и γ-радиация, озон, 222Rn, космически лъчи и на далечни преноси от различен характер чрез микроядрен тест и молекулярен тест за откриване на евентуални увреждания в ДНК.
За скрининговите анализи бяха използвани два много чувствителни и широко прилагани в генетичния мониторинг методи - молекулярен анализ (comet assay) и микронуклеарен тест. Спецификата на различните растителни видове (дебела клетъчна стена, трихоми и др.), обусловена от адаптацията към средата на обитаване – голяма надморска височина, температура, UV радиация, обща β- и γ-радиация и др., наложи адаптация и на двата метода към всеки вид.
Предоставеният биологичен растителен материал беше обработен, като молекулярният анализ (comet assay) беше успешно приложен и адаптиран в лабораторията по „Генетичен мониторинг“ на видовете: теснолистна върбовка (Epilobium angustifolium) и ежова главица (Dactylis glomerata). При анализите на растенията, взети от експерименталните площадки на 1500 м. н. в. и 1782 м. н. в. беше установена видова разлика в чувствителността на ДНК към увреждания. При видовете от 1500 м. ДНК на теснолистната върбовка е по-чувствителна на увреждания от тази на ежовата главица.
Същите видове, съответно на малко по-голяма височина - 1782 м. не показаха повишаване на нивото на увреждане на ДНК, като отново се забелязва видова чувствителност, по-силно изразена при теснолистната върбовка
Молекулярният анализ при растения от в. Мусала 2925 м. беше проведен на правоцветно пропадниче (Pedicularis orthantha). Нивото на индуцираните повреди, изразяващи се в количеството на ДНК в опашката беше сравнимо с това на ежовата главица на по-ниски надморски височини.
Микроядреният анализ беше адаптиран за следните видове: теснолистната върбовка, горска ягода, незабравка, ежова главица, алпийска ливадина, гълъбовосиня гъжва, сенчеста каменоломка, планински равнец и правоцветно пропадниче. Според чувствителността им към УВ радиация, ß-радиация и др. фактори от околната среда, растенията от 1500 м. н. в. могат да бъдат подредени в следния ред: горска ягода > незабравка >теснолистна върбовка> ежова главица.
За ДНК чувствителността на видовете, растящи на 1782 м. към увреждания, беше установена подобна тенденция: горска ягода > незабравка > теснолистна върбовка > ежова главица.
Растителните видове от сем. житни Poaceae от вр. Мусала 2925 м., показват изключително ниска честота на микроядра.
Всички други тревисти растителни видове не показаха достоверна разлика по отношение на този показател за увреждания с растенията от по-ниска надморска височина. Незабравката от в. Мусала на 2925 м. не показа достоверна разлика в честотата на индуцираните микроядра в сравнение с растенията от по-ниска надморска височина.
Получените данни и с двата теста за генотоксичност предполагат видова специфичност и изработване на защитни механизми от растенията от различни местообитания и височини на Рила за преодоляване на предизвикания от УВ радиация, ß-радиация, космическите лъчи, парниковите газове други фактори на околната среда стрес на клетъчно и ДНК ниво.
Получените данни са първите стъпки в мониторинга на комбинираното въздействие на естествения радиоактивен фон, UV радиацията, климатичните промени и космическите лъчи.
Участници в изпълнението на дейностите по работния пакет:
доц. д-р Габриеле Йовчев, ИБЕИ-БАН,
гл. ас. д-р Светла Гатева, ИБЕИ-БАН
гл. ас. д-р Цвета Ангелова, ИБЕИ-БАН
През вегетационния период на 2019 и 2020 г. бяха осъществени 4 командировки в Рила планина, като беше събран растителен материал от експерименталните площадки в местност „Скакавците“ над с. Бели Искър, 1500 м. н.в., местност „Трети прозорец“ с 1782 м. н.в. и връх Мусала 2925 м. н.в.
Като контролна площадка беше избрана София 595 м н.в. („Борисова градина“ и „Северен парк“).
Събрани бяха следните видове:
1. От „Борисова градина“ и „Северен парк“, София 595 м н.в. - Fragaria vesca L. (Rosaceae), Myosotis sylvatica Ehrh. (Boraginaceae), Achillea millefolium L. (Asteraceae), Epilobium angustifolium L. (Onagraceae) и Dactylis glomerata L. (Poaceae).
2. От „Скакавците” 1500 м н.в., - Fragaria vesca L. (Rosaceae), Myosotis sylvatica Ehrh. (Boraginaceae), Achillea clusiana Tausch. (Asteraceae), Epilobium angustifolium L. (Onagraceae) и Dactylis glomerata L. (Poaceae).
3. От „Трети прозорец” 1782 м н.в. - Fragaria vesca L. (Rosaceae), Myosotis sylvatica Ehrh. (Boraginaceae), Achillea clusiana Tausch. (Asteraceae), Epilobium angustifolium L. (Onagraceae) и Dactylis glomerata L. (Poaceae).
4. От връх Мусала 2925 м н.в. през вегетационния сезон на 2019 г. - Myosotis sylvatica Ehrh. (Boraginaceae), Achillea multifida (DC.) Griseb. (Asteraceae), Achillea clusiana Tausch. (Asteraceae), Saxifraga pedemontana All. (Saxifragaceae), Poa alpina L. (Poaceae), Festuca valida (R.Uechtr.) Pénzes (Poaceae) и Sesleria coerulans Friv. (Poaceae).
През вегетационния сезон на 2020 г. - Saxifraga cymosa Waldst & Kit. (Saxifragaceae), Anthemis carpatica Waldst. & Kit. ex Willd. (Asteraceae), Geum repens L. (Rosaceae), Doronicum columnae Ten. (Asteraceae), Achillea cluisiana Tausch. (Asteraceae), Campanula alpina Jacq. (Campanulaceae), Pedicularis orthantha Griseb. (Scrophulariaceae), Allium sibiricum L. (Liliaceae), Festuca valida (R.Uechtr.) Pénzes (Poaceae).
Събраните растения са характерни за съответните местообитания. За да се охарактеризират и проследят промените, настъпили в генетичния материал в резултат от УВ радиацията, йонизиращата радиация, озонът, космическите лъчи и далечните преноси от различен характер в изследването бяха използвани молекулярни и цитогенетични тестове.
- молекулярен анализ (comet assay) - чувствителен метод, позволяващ установяване на увреждания, индуцирани от различни генотоксини или физични фактори от различен произход в единични клетки.
- цитогенетичен анализ (микроядрен тест) – чувствителен и широко прилаган в анализите за генотоксичност.
Допълнително бяха направени и биохимични анализи.
Проучена и сравнена беше чувствителността на ДНК на различните растителни видове на увреждане от комплекса от абиотични фактори на различна надморска височина. Comet assay беше успешно приложен и адаптиран на теснолистна върбовка (E. angustifolium), ежова главица (D. glomerata), бял равнец (A. clusiana) и планински равнец (A. multifida), сенчеста каменоломка (S. pedemontana) и мощна власатка (F. valida).
Микроядрен тест
Микроядреният тест беше адаптиран за следните видове: теснолистна върбовка, горска ягода, незабравка, ежова главица, алпийска ливадина, гълъбовосиня гъжва, сенчеста каменоломка и планински равнец.
Допълнително бяха изследвани ДНК повредите и индукцията на микроядра в контролното ненеповлияно растение H. vulgare (Poaceae).
Comet assay (Кометен анализ)
Comet assay беше приложен на 4 растителни вида: теснолистна върбовка (E. angustifolium), ежова главица (D. glomerata), два подвида равнец (A. mulltifida) (A. clusiana), като беше направено сравнение с данните от предния вегетационен сезон. Като контрола беше използвано моделното растение H. vulgare, отгледано в стандартни лабораторни условия.
Получените данни и с двата теста за генотоксичност предполагат видова специфичност и изработване на защитни механизми от растенията от различни местообитания и височини на Рила за преодоляване на предизвикания от УВ радиация, ß-радиация, космическите лъчи, парниковите газове други фактори на околната среда стрес на клетъчно и ДНК ниво.
Получените данни са първи стъпки в мониторинга на комбинираното въздействие на естествения радиоактивен фон, UV радиацията, климатичните промени и космическите лъчи върху растителни видове.
Установена е видова специфичност по отношение чувствителността на ДНК на диви растения към увреждане, индуцирано от комбинираното въздействие на стрес фактори от околната среда на различни надморски височини в Рила.
ДНК на видовете от семейство Poaceae е по-малко чувствителна към увреждане, което предполага по-високата им степен на адаптация към условията на околната среда, в сравнение с другите видове и на трите височини. По-ниските нива на увреждане на ДНК на растенията от Poaceae съответстваха и на по-ниска способност на тези растения да акумулират радионуклиди.
Ниското ниво на ДНК уврежданията при растителните видове от най-голяма надморска височина показва тяхната успешна адаптация към алпийските условия на средата.
Проследяването на промените в ДНК уврежданията на растенията през трите последователни сезона и изменението на параметрите на околната среда показва известна зависимост.
Първоначалните данни са обещаващи, като по-нататъшните проучвания биха допринесли да се разберат механизмите, свързани с реакциите на растенията на UV радиация и други абиотични фактори, както и как различните фактори взаимодействат и предизвикват адаптацията на растенията към непрекъснатите промени в условията на околната среда.
Лабораторен експеримент с моделен обект Hordeum vulgare (ечемик), подложен на UV облъчване
Експериментът е продължение на стартиралия през първия етап на проекта лабораторен опит с тест-система H. vulgare стандартен кариотип (2n=14) при дефинирани условия, симулиращи UV-фона през вегетативния период във високопланински условия.
Експериментът е продължение на стартиралия през първия етап на проекта лабораторен опит с тест-система H. vulgare стандартен кариотип (2n=14) при дефинирани условия, симулиращи UV-фона през вегетативния период във високопланински условия.
Дозата UV светлина беше проектирана на базата на времето за осветяване и моментната UV мощност по време на осветлението. По този начин системата за мониторинг на UV в реално време регистрираше типичното облъчване на стойност от 18 mW/m2 на час за UV-A + UV-B. Дневната UV доза бе изчислена експериментално, въз основа на полевите (40-дневни) UV измервания при високопланинската изследователска станция на връх Мусала - 2925 м н.в. Дозата UV, измерена там през летния сезон 2017-2018, юни-юли бе приета като максимална дневна UV доза, която може да се натрупа при местните климатични условия. UV въздействието в лабораторния експеримент беше адаптирано към реалните условия на връх Мусала (2925 м н.в.), а именно 28.004 ± 0.654 Wh/m2 за цялото времетраене на експеримента (43 дни). Долните надморски височини от 1500 м н.в. и 1782 м н.в. показаха по-ниска експозиция - 24 Wh/m2, което не беше взето предвид при лабораторния експеримент.
Бяха анализирани нивата на индуцирани микроядра и степента на увреждания на ДНК (кометен анализ) в листни и коренови клетки на H. vulgare на 10, 20, 30 и 43 дни след UV-облъчването.
Ечемичените растения, облъчени в лабораторни условия имаха по-високи нива на микроядра (МЯ) от установените в растения при планински условия.
След 20-дневна UV-A и UV-B експозиция в лабораторни условия беше наблюдавана адаптация, като нивото на МЯ беше значимо по-ниско.
Резултатите, получени с молекулярния метод (кометен анализ), показаха същата тенденция. Първоначалното увреждане на ДНК, отчетено 10 дни след UV експозицията беше нормализирано след 20-дневното облъчване до нивото на неповлияните растения.
Допълнителни изследвания - съдържание на фотосинтетични пигменти (общи хлорофили, хлорофил а, хлорофил b, общи каротеноиди, хлорофилно съотношение).
За определяне на пигментното съдържание бяха събрани растения от трите площадки на Рила 1500 м н.в., 1782 м н.в. и 2925 м н.в. и контролната в гр. София 595 м н.в., през вегетационния сезон юли-август на 2020 г.
За биохимичното изследване е използван растителен материал от пет диворастящи вида растения, характеристика на екосистемите в Рила: F. vesca L. (Rosaceae), M. sylvatica Ehrh. (Boraginaceae), A. millefolium L. (Asteraceae), E. angustifolium L. (Onagraceae) и D. glomerata L. (Poaceae). Растенията са събрани от три различни височини в Рила: местност Скакавците - 1500 м н. в. и III прозорец - 1782 м н. в. през юли-август 2020 г. Като контролна височина е избрана София-595 м н. в.
Настоящите изследвания показват видовата специфичност и чувствителност към факторите от околната среда, както и степента на адаптация към постоянно променящите се условия на средата. За по-добро разбиране на механизмите на взаимодействие между абиотичните фактори и реакцията на адаптация на растенията към променящите се условия на околната среда ще допринесат по-нататъшни проучвания с повече от една крайна точка.
Въз основа на получените от нас данни, би могло да се избере чувствителен, индикаторен вид за сравнение и оценка на въздействието от околната среда.
